Фрагменты антител в терапии. Основные функции Fab и Fc-фрагментов Fab fc фрагменты

Антитела (Ат) - эффекторные молекулы гуморального иммунитета. Синтез антител запускают Аг, поступающие в организм извне (при инфекциях, вакцинации, действии ксенобиотиков) или образующиеся эндогенно. Как правило, AT специфически взаимодействует с комплементарным Аг. Существуют, однако, антитела, взаимодействующие с Аг-детерминантами, общими для различных Аг. Такие антитела известны как перекрёстнореагирующие, или гетероспецифичные.

Антитела существуют в миллионах разновидностей, и каждая молекула имеет уникальный участок связывания Аг-детерминанты. В большинстве случаев антитела представлены сывороточными гликопротеинами , мигрирующими в составе медленной фракции гамма-глобулинов при электрофорезе белков сыворотки крови. Поэтому для обозначения сывороточной фракции AT иногда применяют термин «гамма-глобулины ».

Антитела также называют «иммуноглобулины» . Антитела (Ат) образуют одну из основных фракций белков крови, составляя 20% массы общего белка плазмы. AT устойчивы к действию слабых кислот и щелочей, а также к нагреванию до 60 °С.

Структурная единица AT - мономер - молекула цилиндрической формы, состоящая из двух идентичных тяжёлых Н-цепей [от англ. heavy, тяжёлый] и двух идентичных лёгких L-цепей [от англ. light лёгкий]. Тяжёлые и лёгкие цепи Ig состоят из аминокислотных остатков и соединены дисульфидными (-S-S-) связями. В цепях различают вариабельную область, или V-область [от англ. various, разный], и константную область, или С-область [от англ. constant, постоянный]. V-область у разных AT варьирует. V-области L- и Н-цепей образуют Аг-связывающий центр (активный центр AT, паратоп), или Fab-фрагмент [от англ. fragment фрагмент, + antigen binding, связывающий Аг]. Константная область молекулы называется Fc-фрагмент [от англ. fragment crystallizable, фрагмент кристализации].

В месте соединения Fab- и Fc-фрагментов расположена шарнирная область, позволяющая Аг-связывающим фрагментам разворачиваться для более тесного контакта с Аг.

Область молекулы антител (Fab) определяет антигенную специфичность, а Fc осуществляет эффекторные функции.

Fab-фрагменты антитела взаимодействуют с антигенными детерминантами. Аг-связывающий центр комплементарен эпитопу Аг (принцип ключ-замок). Связывание Аг с AT нековалентно и обратимо. Аффинность (сродство) Аг к антителу определяется физико-химическими свойствами взаимодействующих молекул и соотношением концентраций связанных и свободных Аг и антител. На сродство влияют пространственное соответствие взаимодействующих участков молекул, электростатические, гидрофобные взаимодействия и силы Ван дер Ваальса.

Авидность - интегральная характеристика силы связи между Аг и AT, учитывающая взаимодействие всех активных центров с эпитопами Аг.

Валентность антитела - число активных (Аг-связывающих) центров антитела. Молекула полного Ig как минимум двухвалентна. Такие антитела известны как полные антитела; мономеры с меньшей валентностью - неполные антитела.

Полные антитела (в частности, IgM, IgG) вызывают агрегацию Аг, видимую невооружённым глазом (например, РА бактерий).

Неполные антитела содержат один Аг-связывающий центр и, поэтому, одновалентны (например, антитела, вырабатываемые при бруцеллёзе). Второй Аг-связывающий центр у подобных Ig экранирован различными структурами либо обладает низкой авидностью.

Неполные антитела функционально дефектны, так как не способны агрегировать Аг. Неполные AT могут связывать эпитопы Аг, препятствуя контакту с ними полных антител; поэтому их также называют блокирующими антителами .

Fc-фрагмент антитела

Константные участки тяжёлых цепей определяют характер взаимодействий антитела с клетками и молекулами иммунной системы, в частности специфичность связывания молекулы Ig с клетками-эффекторами (например, фагоцитами, тучными клетками), несущими на своей поверхности рецепторы к Fc-фрагменту.

Fc-фрагмент определяет также эффекторные функции антитела (например, активацию комплемента). Для реализации этих свойств сразу после связывания Аг Fab-фрагментами происходят конформационные изменения структуры Fc-фрагментов. Пространственно изменённые Fc-фрагменты распознают фагоциты, именно они способствуют фиксации С1а-компонента комплемента и запуску комплементарного каскада по классическому пути. В противном случае ни клетки, ни эффекторные молекулы были бы не в состоянии отличить интактные AT или антитела, связавшие Аг.

Взаимодействие антител с антигеном включает специфическую и неспецифическую фазы.

Специфическая фаза протекает быстро и представляет специфическое взаимодействие активного центра с Аг.

Неспецифическая фаза протекает медленнее, зависит от присутствия электролитов и свойств Аг. Корпускулярные Аг агрегируются в крупнодисперсные конгломераты и выпадают в осадок (феномен агглютинации).

Растворимые Аг образуют мелкодисперсные конгломераты (феномен преципитации), проявляющиеся помутнением раствора или образованием колец преципитации либо зон преципитации в гелях.

Константные участки лёгких цепей бывают двух типов - каппа (к) и ламбда; константные участи тяжёлых цепей представлены пятью основными формами - мю (р), гамма (у), дельта (8), альфа (а) и эпсилон (е). Каждая из них ассоциирована с отдельным классом Ig. Выделяют 5 классов AT: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM .

Молекулы IgG, IgD и IgE представлены мономерами, IgM - пентамерами; молекулы IgA в сыворотке крови - мономеры, а в экскретируемых жидкостях (слёзная жидкость, слюна, секреты слизистых оболочек) - димеры.

IgM синтезируются при первичном попадании Аг в организм. Пик образования приходится на 4-5-е сутки с последующим снижением титра. Образование IgM к некоторым Аг (например, жгутиковым Аг бактерий) осуществляется постоянно. К IgM относят значительную часть AT, вырабатывающихся к Аг грамотрицательных бактерий.

Наличие IgM к Аг конкретного возбудителя указывает на острый инфекционный процесс.

Молекула IgM - пентамер; пять субъединиц соединены J-цепью [от англ. joining, связывающий], в результате чего молекула IgM приобретает 10 Аг-связывающих участков.

Молекулы IgM опсонизируют, агглютинируют, преципитируют и лизируют содержащие Аг структуры, а также активируют систему комплемента по классическому пути (для комплементзависимого лизиса бактерии достаточно одной молекулы IgM).

Иммуноглобулин G (IgG) - основной класс AT (до 75% всех Ig), защищающий организм от бактерий, вирусов и токсинов. После первичного контакта с Аг синтез IgM обычно сменяется образованием IgG.

Максимальные титры IgG при первичном ответе наблюдают на 6-8-е сутки. Обнаружение высоких титров IgG к Аг конкретного возбудителя указывает на то, что организм находится на стадии реконвалесценции или конкретное заболевание перенесено недавно. В особо больших количествах IgG синтезируется при вторичном ответе.

IgG представлены 4 подклассами: IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4; их относительное содержание (в %) составляет соответственно 66-70, 23, 7-8 и 2-4. IgG непосредственно участвуют в реакциях иммунного цитолиза, реакциях нейтрализации, а также усиливают фагоцитоз, действуя как опсонины и связывая рецепторы Fc-фрагмента в мембране фагоцитирующих клеток (в результате этого фагоциты эффективнее поглощают и лизируют микроорганизмы).

Только IgG способны проникать через плаценту, что обеспечивает формирование у плода пассивного иммунитета.

Иммуноглобулины А (IgA) циркулируют в сыворотке крови (составляет 15-20% от всех Ig), а также секретируются на поверхность эпителия. Присутствуют в слюне, слёзной жидкости, молоке и на поверхности слизистых оболочек.

AT класса IgА усиливают защитные свойства слизистых оболочек пищеварительного тракта, дыхательных, половых и мочевыделительных путей. В сыворотке крови IgA циркулируют в виде двухвалентных мономеров; в секретируемых жидкостях преобладают четырёхвалентные димеры, содержащие одну J-цепь и дополнительную полипептидную молекулу (синтезируемый эпителиальными клетками секреторный компонент).

Эта молекула присоединяется к мономерам IgA в ходе их транспорта через эпителиальные клетки на поверхность слизистых оболочек. Секреторный компонент участвует не только в связывании молекул IgA, но обеспечивает их внутриклеточный транспорт и выделение на поверхность слизистых, а также защищает IgA от переваривания протеолитическими ферментами.

Молекулы IgA участвуют в реакциях нейтрализации и агглютинации возбудителей. Кроме того, после образования комплекса Аг-АТ они участвуют в активации комплемента по альтернативному пути.

Иммуноглобулин Е (IgE) специфически взаимодействуют с тучными клетками и базофильными лейкоцитами, содержащими многочисленные гранулы с БАВ. Их выделение из клетки (дегрануляция) вызывает резкое расширение просвета венул и увеличение проницаемости их стенки. Подобную картину можно наблюдать при аллергических реакциях (например, бронхиальной астме, аллергическом рините, крапивнице).

Аг-связывающие Fab-фрагменты молекулы IgE специфически взаимодействуют с Аг, попавшим в организм. Сформированный иммунный комплекс взаимодействует с рецепторами Fc-фрагментов IgE, встроенных в клеточную мембрану базофила или тучной клетки. Это взаимодействие и является сигналом для дегрануляции с высвобождением гистамина и других БАВ и развёртыванием острой аллергической реакции.

1. Тема лекции: «Система гуморального иммунитета Дифференцировка В-лимфоцитов. Строение иммуноглобулина G»

2. Цель: Ознакомить студентов с основными функциямиВ-системы иммунитета, рассмотреть основные этапы дифференцировки В-лимфоцитов,строение и функции иммуноглобулинаG.

3. Тезисы лекции:

Основные функции В-системы.

Химическое строение иммуноглобулина G.

Функции Fab и Fc-фрагментов иммуноглобулинов

Система гуморального иммунитета – это специализированная система, главной функцией которой является синтез антител против антигенов. Функциональная активность системы гуморального иммунитета в большинстве случаев зависит от тесного взаимодействия с Т-системой иммунитета и антигенпредставляющими клетками.

Главными клетками системы гуморального иммунитета являются В-лимфоциты, ответственные за синтез антител. Участие антител в реализации гуморального иммунного ответа связано с образованием иммунных комплексов с растворимыми и корпускулярными антигенами. В составе иммунных комплексов антигены подвергаются изоляции и/или уничтожению.

Главной функцией антител является специфическое связывание антигена. Специфическое взаимодействие антигенов и антител основано на пространственном соответствии, или комплементарности, существующем между ними.

В молекуле IgGсодержится 4 полипептидные цепи: 2 тяжелые и 2 легкие. В непосредственный контакт с антигеном вступают аминокислоты так называемой гипервариабельной области V-доменов. Полость активного центра находится между вариабельными участками тяжелой и легкой цепей и по форме точно соответствует определенной гаптенной группировке. Фрагмент, содержащий постоянные домены обеих тяжелых цепей (2 СН 2 , и 2СН 3), называется Fc-фрагментом.

Основные функции Fab и Fc-фрагментов

Главная функция Fab-фрагмента - связывание антигена , т.к. в его состав входит активный антигенсвязывающий центр молекулы иммуноглобулина, сформированный V H и V L -доменами тяжелой и легкой цепей.

Функции Fс-фрагмента:

1. Разные классы иммуноглобулинов отличаются между собой по строению Fс-фрагментов. Эти различия могут касаться как количества СН-доменов, входящих в состав Fc-фрагментов, так и их аминокислотного состава (могут быть дополнительные домены, например, СН 4 у IgM и IgE). Благодаря различиям в строении Fc-фрагментов, классы иммуноглобулинов различаются и по функциям.

2. С помощью Fс-фрагментов происходит полимеризация молекул иммуноглобулинов. Например, секреторный IgA образует димеры и тримеры, сывороточный IgМ является пентамером.

3. В Fc-фрагментах IgМ, IgG 1 и IgG 3 при связывании с антигеном происходит структурное изменение, в результате которого в области СН 2 -домена возникает активный участок, связывающий первый компонент системы комплемента, поэтомуэти классы иммуноглобулинов у человека вызывают активацию системы комплемента по классическому пути .

4. С помощью Fс-фрагментов молекулы иммуноглобулинов встраиваются в плазматическую мембрану В-лимфоцитов и являются антигенраспознающими рецепторами .

5. На поверхности многих клеток организма имеются Fс-рецепторы к разным классам иммуноглобулинов . Если к этим рецепторам прикрепляются соответствующие иммуноглобулины или иммунные комплексы, в состав которых входят эти иммуноглобулины, точерез эти рецепторы может происходить активация или подавление функций соответствующих клеток .

4. Иллюстративный материал: мультимедийная лекция №2

Оглавление темы "Гуморальные имунные реакции. Основные типы антител. Динамика антителообразования.":

Fab-фрагменты антитела взаимодействуют с антигенными детерминантами. Аг-связывающий центр комплементарен эпитопу Аг (принцип ключ-замок). Связывание Аг с AT нековалентно и обратимо. Аффинность (сродство) Аг к антитела определяется физико-химическими свойствами взаимодействующих молекул и соотношением концентраций связанных и свободных Аг и антител . На сродство влияют пространственное соответствие взаимодействующих участков молекул, электростатические, гидрофобные взаимодействия и силы Ван дер Ваальса.

Авидность - интегральная характеристика силы связи между Аг и AT, учитывающая взаимодействие всех активных центров с эпитопами Аг.

Валентность антитела - число активных (Аг-связывающих) центров антитела . Молекула полного Ig как минимум двухвалентна. Такие антитела известны как полные антитела ; мономеры с меньшей валентностью - неполные антитела .

Полные антитела (в частности, IgM, lgG) вызывают агрегацию Аг, видимую невооружённым глазом (например, РА бактерий).

Неполные антитела содержат один Аг-связывающий центр и, поэтому, одновалентны (например, антитела , вырабатываемые при бруцеллёзе). Второй Аг-связывающий центр у подобных Ig экранирован различными структурами либо обладает низкой авидностью.

Неполные антитела функционально дефектны, так как не способны агрегировать Аг. Неполные AT могут связывать эпитопы Аг, препятствуя контакту с ними полных антител ; поэтому их также называют блокирующими антителами .

Fc-фрагмент антитела

Константные участки тяжёлых цепей определяют характер взаимодействий антитела с клетками и молекулами иммунной системы, в частности специфичность связывания молекулы Ig с клетками-эффекторами (например, фагоцитами, тучными клетками), несущими на своей поверхности рецепторы к Fc-фрагменту.

Fc-фрагмент определяет также эффекторные функции антитела (например, активацию комплемента). Для реализации этих свойств сразу после связывания Аг Fab-фрагментами происходят конформационные изменения структуры Fc-фрагментов. Пространственно изменённые Fc-фрагменты распознают фагоциты, именно они способствуют фиксации С1а-компонента комплемента и запуску комплементарного каскада по классическому пути. В противном случае ни клетки, ни эффекторные молекулы были бы не в состоянии отличить интактные AT или антитела , связавшие Аг.

УДК 577.322.24

Д. О. Дормешкин, магистрант (БГТУ);

В. Н. Леонтьев, кандидат химических наук, доцент, заведующий кафедрой (БГТУ);

И. Г. Ивашкевич, кандидат химических наук (ИБОХ НАН Беларуси);

А. А. Гилеп, кандидат химических наук, заведующий лабораторией (ИБОХ НАН Беларуси)

ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ FAB-ФРАГМЕНТОВ АНТИТЕЛ, СПЕЦИФИЧНЫХ К КОРТИЗОЛУ

В данной работе проведено молекулярное клонирование генов, кодирующих структуру иммуноглобулинов мыши, специфично связывающих стероидный гормон кортизол. Для этого сконструированы праймеры, охватывающие все семейство генов, кодирующих структуру иммуноглобулинов класса G. Созданы молекулярно-генетические конструкции для эффективной экспрессии рекомбинантных антител в клетках Escherichiacoli. Проведена гетерологическая экспрессия Fab-фрагментов антител. Рекомбинантный белок получен в гомогенном состоянии.

The paper dwells upon the molecular cloning of genes coding the structure of mouse immunoglobulins, which can specifically bind steroid hormone cortisol. For these purposes primers, covering all families of genes, which code the structure of immunoglobulins G and molecular-genetic constructions for effective expression of recombinant antibodies in Escherichiacoli, were constructed. Heterologous expression of Fab-fragments was performed. Recombinant protein has been isolated in homogenous state.

Введение. Кортизол (рис. 1) является одним из важнейших стероидных гормонов и необходим для поддержания многих функций организма. Как и другие глюкокортикостерои-ды, кортизол синтезируется в пучковой зоне коры надпочечников из общего предшественника холестерина . Измерение уровня стероидного гормона кортизола в крови имеет большое значение для мониторинга функции гипофиза и коры надпочечников. В настоящее время существует большое множество диагностических систем для количественного определения кор-тизола в биологических жидкостях. Большинство из них так или иначе используют принцип аффинного узнавания кортизола соответствующими антителами (иммуноглобулинам). Актуальной задачей является улучшение функциональных свойств узнающего модуля диагностических систем, а также удешевление их себестоимости. Один из возможных путей решения этой задачи - использование рекомби-нантных антител, обладающих более широким спектром свойств по сравнению с полноформатными антителами.

Рис. 1. Структурная формула кортизола

Иммуноглобулины - семейство гликопро-теинов, представленных в плазме крови и

тканевых жидкостях позвоночных, способных распознавать и связывать чужеродные для организма вещества (антигены). Участок антигена, с которым взаимодействует антитело, называется эпитопом, а участок антитела, за счет которого оно взаимодействует с антигеном, - паратопом .

У высших млекопитающих иммуноглобулины представлены пятью классами ^О, ^М, ^А, ^Е и ^Б. Наибольший практический интерес представляет самый распространенный класс - ^О, который представлен в организме человека четырьмя подклассами (изотипами): ^1, ^2, ДОЗ и ^4.

Иммуноглобулин представляет собой муль-тимерный белок, состоящий из двух идентичных тяжелых цепей и двух легких (рис. 2).

Тяжелая цепь Лёгкая цепь

Рис. 2. Строение молекулы иммуноглобулина

232 ISSN 1683-0377. Труды БГТУ. 2013. № 4. Химия, технология органических веществ и биотехнология

Молекула иммуноглобулина условно может быть разделена на две функциональных субъединицы - Fab-фрагмент (fragment-antigenbinding) и Fc-фрагмент (fragment crystallizable). Fс-фраг-мент состоит из двух пар константных доменов (CH2 и CH3) и отвечает за взаимодействие с клеточными рецепторами при активации иммунного ответа, а также с белками системы комплимента. Fab-фрагмент участвует в распознавании антигена и состоит из одного вариабельного участка (VL и VH) и одного константного (CL и CH1). Между собой отдельные полипептидные цепи связаны дисульфидными связями и нековалентными взаимодействиями . Кроме того, на уровне CH2 участка молекула гликозилирована.

С развитием молекулярно-генетических технологий широкое распространение получили мини-антитела: Fab- (fragment antigen binding) и scFv- (single chain fragment variable) фрагменты, которые способны специфично связывать антиген, но обладают большей проникающей способностью, чем полноразмерные антитела . Fab-фрагмент представляет собой белок массой 50 кДа, состоящий из участка тяжелой цепи (VH и CH1) и легкой цепи, соединенных вместе дисульфидными связями и нековалентными взаимодействиями. Фрагмент, состоящий только из вариабельных участков (VH и VL), соединенных между собой пептидым линкером, представляет собой scFv-фрагмент и обладает молекулярной массой 15 кДа. Рекомбинантные мини-антитела могут быть получены в бактериальной системе экспрессии, в отличие от полноразмерных иммуноглобулинов, Fc-домен которых гликозилирован и, соответственно, требует систем посттрансляционной модификации . Структурой и, соответственно, физико-химическими свойствами фрагментов антител легко манипулировать на генном уровне, и они могут быть превращены в полноразмерные антитела для приобретения эффекторных функций .

Основная часть. Основной задачей являлось получение высокоаффинных Fab-фрагмен-тов антител к стероидному гормону кортизолу.

Моноклональные антитела, продуцируемые гибридомами 5Г-Н2 (получены в Лаборатории химии белковых гормонов ИБОХ НАН Беларуси) способны специфично связывать стероидный гормон кортизол. Однако использование гибридомных линий, продуцирующих мо-ноклональные антитела, имеет ряд существенных недостатков, к которым относятся нестабильность клеточных линий, высокая цена культивирования, невозможность проведение генно-инженерных манипуляций с генами иммуноглобулинов . Кроме того, полученные

по гибридомной технологии антитела могут содержать примеси иммуноглобулинов мыши, которые повышают вероятность ложных результатов при использовании в диагностических системах. Все эти ограничения можно обойти, используя рекомбинантные антитела, полученные с помощью генно-инженерных методов и экспрессируемые в бактериальной системе.

Первым этапом было выделение тотальной РНК из гибридом 5Г-Н2, продуцирующих специфические антитела к стероидному гормону кортизолу. Тотальная РНК выделялась с помощью набора SV Total RNA Isolation (Promega) и использовалась сразу для постановки реакции обратной транскрипции с олиго-^Т)18 прайме-рами для получения кДНК (использовался набор реагентов «Реверта-L» ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора).

Полученная кДНК использовалась к качестве матрицы для амплификация генов, кодирующих структуры тяжелой и легкой цепи иммуноглобулинов. На основе анализа литературных данных и нуклеотидных последовательностей иммуноглобулинов из базы данных IMGT.org были сконструированы специфические вырожденные праймеры, охватывающие все разнообразие генов кДНК, кодирующих легкие и тяжелые цепи иммуноглобулинов класса G мыши. Амплификация проводилась в амплификаторе BioRad Т100 при следующих условиях: денатурация 94оС 4 мин; 30 циклов -денатурация 94оС 1 мин, отжиг 55оС 1 мин, элонгация 72оС 1 мин. Заключительный этап элонгации -72оС 10 мин.

Амплифицированные фрагменты разделяли методом гель-электрофореза в 2%-ном агароз-ном геле с использованием ТАЕ-буфера в присутствии бромистогоэтидия (результаты регистрировали с помощью видеосистемы Gel Imager 2 («Vilber Lourmat»)). В каждом случае проводили положительный и отрицательный контроль амплификации.

После ПЦР продукты амплификации клонировали в вектор pXcmkn12 и секвенировали для подтверждения правильности последовательности клонированной ДНК (определение нуклеотидной последовательности проводили с использованием наборов «ABI PRISM BigDye Terminator v3.1 Ready Reaction Cycler Sequencing Kit», «Big Dye X Terminator Purification Kit» исеквенатора Applied Biosystems 3130). Секве-нирование показало, что клонированная тяжелая цепь относится к типу G2a, что согласуется с изотипом продуцируемых гибридомой антител, а легкая цепь - к типу к.

Для экспрессии Fab-фрагментов антител использовался специально сконструированный

плазмидный вектор pCW-Fab, обеспечивающий высокий уровень экспрессии рекомбинантных антител в периплазматическом пространстве Escherichiacoli .

Для проведения препаративной экспрессии использовались клетки E. coli DH5a, транс-формиованные бицистронным вектором pCW-Fab, содержащим клонированные гены Fab-домена.

Культивирование клеток E. coli DH5a проводилось на TB среде. Индукция клеточной культуры к синтезу белка осуществляли с помощью IPTG (изопропил^^-1-тиогалакто-пиранозид), запускающего транскрипцию посредством индукции лактозного оперона.

Клетки разрушали с использованием гомогенизатора Emulsiflex-C5 при добавлении детергента (CHAPS), ингибитора сериновых про-теаз (PMSF) и ß-меркаптоэтанола. Центрифугированием отделяли разрушенные клетки. Су-пернатант наносился на хроматографическую колонку с ProteinA сефарозой. ProteinA - белок, экспрессирующийся в клетках золотистого стафилококка Staphylococcusaureus и способный аффинно связывать CH1 домен тяжелой цепи иммуноглобулинов.Это позволяет использовать метод аффинной хроматографии для выделения рекомбинантных Fab-фрагментов (использовалась система выделения и очистки белков Bio-Rad «Bio-Logic»).

Гомогенность полученного белка контролировалась с помощью ПААГ электрофореза в де-натурирущих условиях, который показал наличие двух полипептидных цепей с ожидаемой молекулярной массой, что подтверждает эффективность созданных конструкций. Функциональная активность рекомбинантных Fab-фрагментов антител требует дальнейшего изучения.

Заключение. Проведено молекулярное клонирование генов, кодирующих структуру иммуноглобулинов мыши, специфичных к кортизолу. Результаты секвенирования подтвердили принадлежность клонированных фрагментов к классу иммуноглобулинов. Созданные молеку-лярно-генетические конструкции позволили провести гетерологическую экспрессию рекомби-нантных Fab-фрагментов в клетках E.coli. Получен рекомбинантный белок в гомогенном состоянии с соответствующей ожиданиям молекулярной массой. Свойства полученных Fab-фраг-ментов антител требуют дальнейшего изучения.

Коллектив авторов выражает благодарность Лаборатории химии белковых гормонов и лично доктору химических наук Свиридову О. В. и кандидату химических наук Ивашкевич И. Г. за любезно предоставленные клеточные линии гибридом 5Г-Н2.

Литература

1. Spironelli, C. Cortisol and ACTH plasma levels in maternal filicides and violent psychiatric women / C. Spironelli, F. J. Gradante // Psychiatr Res. - 2013. - Vol. 47. - P. 622-627.

2. Иванов, В. Т. Белки иммунной системы. учеб. пособие / В. Т. Иванов; Институт биоорганической химии им. М. М. Шемякина. -М.: ИБХРАН, 1997. - 114 с.

3. Buchner, J. Renaturation, purification and characterization of recombinant Fab-fragments produced in Escherichia coli / J. Buchner, R. Rudolph // Biotechnology (NY). - 1991. - Vol. 9 (2). -P.157-162.

4. Ahmad, Z. A. scFv Antibody: Principles and Clinical Application / Z. A. Ahmad, S. K. Yeap, M. Hamid // Clinical and Developmental Immunology. - 2012. - Vol. 2012. - P. 3-17.

5. Dimitrov, D. S. Therapeutic antibodies:cur-rent state and future trends - is a paradigm change-coming soon? / D. S. Dimitrov, J. D. Marks // Methods in Molecular Biology. - 2009. - Vol. 525. -P. 1-27

6. Jez, J. Significant Impact of Single N-Gly-can Residues on the Biological Activity of Fc-based Antibody-like Fragments / J. Jez, A. Cas-tilho, H. Steinkellner // The Journal of Biological Chemistry. - 2012. - Vol. 29. - P. 24313-24319.

7. Strebe, N. Cloning of Variable Domains from Mouse Hybridoma by PCR / N. Strebe, D. Moosmayer, S. Dubel // Antibody Engineering. -2010. - Vol. 1. - P. 3-14.

8. Rohatgi, S. Systematic design and testing of nested (RT-)PCR primers for specific amplification of mouse rearranged/expressed immu-noglobulin variable region genes from small number of B-cells / S. Rohatgi, P. Ganju, D. Sehgal // Journal of Immunological Methods. - 2008. -Vol. 330. - P. 205-219.